流式細(xì)胞術(shù)(FCM)因其具有標(biāo)準(zhǔn)化流程、操作簡便和高可靠性的特點，長期以來被視為植物基因組大小估算的主流方法。然而，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，K-mer分析作為一種基于測序數(shù)據(jù)的估算手段迅速崛起，可同時提供雜合度、重復(fù)序列等多種基因組結(jié)構(gòu)信息，逐漸成為研究熱點。兩者在精度、適用范圍及數(shù)據(jù)要求上存在顯著差異，在基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物種中尤為明顯。

黃杞屬(Engelhardia)作為胡桃科典型的熱帶樹種，物種分化明顯但基因組研究基礎(chǔ)有限，是探索不同估算方法適用性的理想對象。該研究以黃杞屬5個代表物種為研究材料，系統(tǒng)比較了流式細(xì)胞術(shù)與K-mer分析在基因組大小估算中的準(zhǔn)確性與局限性，旨在為非模式植物基因組大小估算方法的選擇提供實證參考。對此，中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園(以下簡稱“版納植物園”)植物系統(tǒng)發(fā)育與多樣性保護(hù)研究組開展了相關(guān)研究。

研究表明K-mer分析不僅可同時提供基因組大小(724–1,130 Mb)、雜合度(0.45%–1.08%)與重復(fù)序列比例(13.8%–58.3%)等多維度的基因組特征信息(圖1a-e)，還能適用于無新鮮組織樣本、僅有測序數(shù)據(jù)的情況，尤其適合缺乏細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)的非模式植物研究。但該方法存在以下局限性：1.在高雜合度物種(如E. spicata各變種及E. roxburghiana)中，因異源位點引發(fā)次級K-mer峰易被誤判為主峰，導(dǎo)致基因組大小顯著低估;2.在重復(fù)序列比例高的物種(如E. fenzelii，重復(fù)比例高達(dá)58.3%)中，K-mer分布圖形主峰扁平或模糊，模型擬合偏低，從而導(dǎo)致基因組大小高估;3.估算結(jié)果高度依賴K值(k-mer長度)等參數(shù)設(shè)置，K值越小越可能高估重復(fù)序列比例，且模型R2值與殘差也受到顯著影響。

相比之下，F(xiàn)CM方法結(jié)果穩(wěn)定(800–870 Mb)、重復(fù)性好(圖2a-e)，并在標(biāo)準(zhǔn)化條件下能精確地反映細(xì)胞核DNA含量，尤其是E. roxburghiana FCM測值與高質(zhì)量參考基因組組裝大小(884.78 Mb)高度吻合(差距<4%)。但FCM也存在局限：需使用新鮮組織或精細(xì)保存的細(xì)胞核;染色條件(如PI染料)、內(nèi)標(biāo)植物選擇及樣品中次生代謝物均可能干擾結(jié)果。

研究最終指出，F(xiàn)CM操作簡便、成本低廉，依然適用于非模式植物中基因組大小的初步評估;K-mer方法則在擁有高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)時能提供更豐富的結(jié)構(gòu)信息。兩種方法在各自優(yōu)勢基礎(chǔ)上，應(yīng)依據(jù)具體研究目標(biāo)進(jìn)行互補(bǔ)整合，以提高基因組大小估算的準(zhǔn)確性與實用性。研究的核心在于挑戰(zhàn)了“K-mer分析全面優(yōu)于FCM”的技術(shù)偏見，提出方法選擇應(yīng)基于研究目標(biāo)：FCM適合快速、準(zhǔn)確的初步估算，而K-mer分析可在高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)支持下，補(bǔ)充基因組結(jié)構(gòu)與復(fù)雜度信息。對于黃杞屬這類缺乏基因組資源的非模式植物，整合兩種方法才能實現(xiàn)準(zhǔn)確的基因組大小估算。相關(guān)研究以Is it time to abandon the flow cytometry in estimations of genome size when the K-mer analysis is available?The case of Engelhardia species為題發(fā)表于Genomics Communications上。版納植物園植物系統(tǒng)與多樣性保護(hù)研究組碩士研究生李敏為該文的第一作者。孟宏虎副研究員、李捷研究員和蘭州大學(xué)生態(tài)學(xué)院武生聃教授為該文通訊作者。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、“西部之光”人才計劃、云南省“興滇英才支持計劃”以及中國科學(xué)院東南亞生物多樣性研究中心的資助。

圖1

圖2